Borelioza Antygeny

Rozpoznawanie, profilaktyka i leczenie chorób wewnętrznych, choroby wieku starszego, choroby zakaźne, układu oddechowego, diabetologia, alergie.
admin. med.

Borelioza Antygeny

Post autor: admin. med. »

Diagnostyka serologiczna choroby z Lyme (boreliozy i zakażeń Borrelia burgdorferi)

Krętek Borrelia burgdorferi należy do rodziny Spirochaetaceae i powoduje boreliozę (chorobę z Lyme). Patogen ten został po raz pierwszy opisany i scharakteryzowany przez W. Burgdorfer’a i A. Barbour’a w 1982 roku. Choroba jest przenoszona przez różne gatunki kleszcza z rodzaju Ixodes. W Europie nosicielem jest kleszcz Ixodes ricinus. Choroba z Lyme jest najbardziej popularną chorobą zakaźną przenoszoną przez kleszcze na świecie.


Borelioza objawia się klinicznie na różny sposób, między innymi poprzez zmiany skórne, zaburzenia w obrębie mięśni szkieletowych, objawy neurologiczne, uszkodzenia układu limfatycznego, zaburzenia kardiologiczne, stany zapalne oka, wątroby, płuc i nerek, oraz objawy ogólnoustrojowe. Podobnie jak w kile, kliniczny przebieg boreliozy przebiega wieloetapowo. Steere zaproponował podział choroby na trzy fazy. Zmiany skórne – rumień wędrujący (EM) o kształcie koła, który pojawia się w miejscu ukąszenia przez kleszcza, jest objawem charakterystycznym dla pierwszej fazy choroby. Następnymi objawami mogą być zaburzenia układu nerwowego (zespół Garin–Bujadoux-Bannwarth) i objawy porażenia (porażenia nerwów czaszkowych) (druga faza choroby). Etap trzeci choroby to zapalenie stawów. Asbrink zmodyfikował powyższy podział, wyróżniając dwie fazy choroby, wczesną i późną boreliozę. Wczesna faza boreliozy jest związana z pojawieniem się zlokalizowanego rumienia wędrującego (zakażenie ograniczone), po tym etapie, w przypadku braku leczenia w ciągu dni lub tygodni, następuje drugie stadium rozsianego zakażenia. W późnej fazie boreliozy z Lyme pojawia się zapalenie stawów lub nawet zanikowe zapalenie skóry (acodermatitis atroficans – ACA), fazę tę obserwuje się rok lub kilka lat po pierwszym ataku choroby. Pacjent może przechodzić tylko jeden etap choroby lub wszystkie etapy choroby; choroba może też rozwijać się bezobjawowo aż do fazy drugiej lub trzeciej.
Podobieństwo objawów choroby z Lyme z objawami innych chorób jest poważnym wyzwaniem diagnostycznym.


O ile w Stanach Zjednoczonych choroba z Lyme jest związana wyłącznie ze szczepem Borrelia burgdorferi sensu stricto, w Europie, do dziś, opisano cztery patogenne dla człowieka szczepy: Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia garinii, Borrelia afzelii oraz Borrelia spielmanii. Tak więc w Europie diagnoza mikrobiologiczna, przy opracowaniu testów, musi uwzględniać różnorodność choroby z Lyme.


Poza diagnozą kliniczną (wywiad i badanie lekarskie) bezpośrednia hodowla Borrelia burgdorferi lub techniki biologii molekularnej (PCR) są najbardziej skutecznym sposobem wykrywania infekcji. Hodowla bakterii z pobranych próbek skóry kończy się powodzeniem w 50 do 70 % przypadków pojawienia się skórnych objawów choroby, ale tylko w 10 do 30 % przypadków neuroboreliozy. Jednak hodowla jest trudna i bardzo czasochłonna, i dlatego badanie to nie jest rutynowo stosowane w diagnostyce zakażeń Borrelia sp. Techniki molekularne, szczególnie rtPCR uważany jest za metodę referencyjną w diagnostyce boreliozy. Po leczeniu jednak pomimo skutecznej antybiotykoterapii przez jakiś czas wynik PCR może nie ulegać negatywizacji, co spowodowane jest zapewne wykrywaniem DNA martwych krętków.


Dlatego też badania serologiczne są najbardziej wygodnym rozwiązaniem dla rutynowych badań laboratoryjnych. Zalecane zazwyczaj podejście diagnostyczne polegające na wykorzystaniu w pierwszym etapie diagnostyki jako metody przesiewowej testu ELISA nie sprawdziło się. Wiadomo bowiem, że wyniki testu ELISA często są fałszywie negatywne, co odsuwa (przynajmniej na jakiś czas) rozpoznanie choroby z Lyme. Zarówno pozytywne, jak i negatywne wyniki testu przesiewowego powinny zostać zawsze zweryfikowane testem typu immunoBlot (Western Blot lub DotBlot). Wysoce wskazane jest też rozpoczynanie diagnostyki boreliozy od wykonania testu Western Blot (z ewentualnym uzupełnieniem jego wyników ilościowym oznaczeniem stężenia swoistych przeciwciał techniką ELISA). Jeśli podejrzewa się występowanie objawów neurologicznych, wykrywanie przeciwciał wytwarzanych wewnątrzoponowo (badanie płynu mózgowo-rdzeniowego) pozostaje ważnym kryterium diagnostycznym. Wynik badania serologicznego zależy od stadium choroby, czasu występowania objawów i ewentualnych wcześniejszych terapii antybiotykowych. Pozytywnych wyników badań serologicznych można oczekiwać najwcześniej w 3-4 tygodniu od zakażenia (ukąszenia przez kleszcza). Tak więc wykonywanie badań w kilka dni po kontakcie z kleszczem (np. w okresie wystąpienia objawów rumienia wędrującego) nie ma uzasadnienia merytorycznego (w przeciwieństwie do intensywnej antybiotykoterapii, która w tym etapie choroby może być najbardziej skuteczna!).


Testy typu Western Blot (lizat krętków rozdzielony elektroforetycznie i przeniesionych na membranę) cechują się jednak wadami, z których najważniejszy wydaje się brak lub niewystarczająca ilość pewnych, ważnych diagnostycznie antygenów oraz obecność dodatkowych, mało istotnych diagnostycznie i powszechnie występujących w innych mikroorganizmach antygenów, które zacierają obraz diagnostyczny. W odróżnieniu od testów typu Line i testów opartych na białkach rekombinowanych, antygeny p100, VIsE, p39 i p18 (białko A wiążące dekorynę, DbpA, Osp17) w lizatach komórek Borrelia burgdorferi są obecne w niewystarczającej ilości. W największym stopniu dotyczy to jednak antygenu OspC. Antygen ten nie jest produkowany (lub jest produkowany w nieznacznych ilościach) przez szczep Borrelia burgdorferi B31, który jest powszechnie wykorzystywany do przygotowania testów diagnostycznych. Także mnogość prążków występujących w teście wykorzystującym lizat może znacznie utrudnić rozróżnienie prążków ważnych z immunologicznego punktu widzenia od prążków powszechnych antygenów, np. białek szoku cieplnego (HSP).
Równocześnie homologiczne białka pochodzące z różnych genotypów mogą znajdować się w jednym teście. Dotyczy to szczególnie wysoko heterogenicznych białek takich jak OspC, VlsE i p18.


W stosowanym teście wykorzystywany jest OspC pochodzące z czterech genogatunków. Również antygen p18 (DbpA) w 40-44% wykazuje homologię sekwencji aminokwasów pomiędzy genogatunkami Borrelii. Dlatego w stosowanym teście zastosowano homologiczne p18 pochodzące od 4 gatunków oraz p18 z dwóch różnych szczepów B. garinii (szczep PBi - serotyp 4 OspA i szczep 20047 - serotyp 0 OspA), określone są w opisie wyników jako OspC z B. garinii 1 i B. garinii 2.
W stosowanym teście dodatkowo poza białkami zewnętrznej błony komórkowej OspA, wykorzystano również antygeny p41 (flagelinę) i p58.



Antygeny wykorzystywane w teście potwierdzenia przeciwciał anty-Borrelia burgdorferi - rekombinowane naniesione na błonę nitrocelulozową.


Antygen Funkcja Gatunek
p100 (p83, p94) białko ściany komórkowej, przypuszczalnie powiązane z flageliną B. afzelii
VIsE vmp (variable major protein) Lipoproteina zewnętrznej błony komórkowej Białko fuzyjne, reprezentuje determinanty antygenowe VIsE z różnych genogatunków
p58 nie scharakteryzowany antygen specyficzny Borrelii B. garinii
p41 Flagellina B. burgdorferi sensu stricto
p39 (BmpA) Białko A błony Borrelia (BmpA) B. afzelii
OspA (p31) Białko zewnętrznej błony komórkowej A B. afzelii
OspC (p23-25) Białko zewnętrznej błony komórkowej C B. burgdorferi sensu stricto, B. afzelii, B. garinii 1, B. garinii 2, B. spielmanii
p18 (DbpA) Białko A wiążące dekorynę (DbpA), Osp17, Białko zewnętrznej błony komórkowej B. burgdorferi sensu stricto, B. afzelii, B. garinii 1, B. garinii 2, B. spielmanii





Odpowiedź immunologiczna na poszczególne antygeny krętka kształtuje się w zależności od zaawansowania klinicznego choroby. We wczesnych fazach (Erythema migrans i neuroborelioza) infekcji stwierdzono wysoką reaktywność OspC (22 kDa, p23-25). Razem z p41 białko to jest immunodominującym antygenem wczesnej odpowiedzi (IgM). Podczas gdy antygen OspC jest immunodominującym markerem dla wczesnej odpowiedzi immunologicznej, antygeny p100 i p18 są szczególnie dobrymi markerami dla późnej odpowiedzi immunologicznej (klasa IgG). Produkcja przeciwciał anty VIsE jest wykrywana głównie jako odpowiedź późna (IgG), często poprzedzająca typowe markery IgG wymienione powyżej. Przeciwciała przeciwko różnym homologom p18 są także ważne dla wczesnej odpowiedzi IgG i dlatego też odgrywają ważną rolę w diagnostyce wczesnej neuroboreliozy.


Negatywny wynik testu potwierdzenia nie może wykluczyć infekcji Borrelia burgdorferi. Zwłaszcza we wczesnej fazie infekcji, możliwe jest, że przeciwciała nie są jeszcze obecne w ilości umożliwiającej wykrycie. Również antybiotykoterapia we wczesnym etapie infekcji może zapobiec powstaniu przeciwciał w ilości umożliwiającej ich wykrycie. Jeśli w badaniach klinicznych podejrzewa się boreliozę, a wyniki badań surowicy krwi są negatywne lub nieoznaczone, pobranie próbki i badanie należy powtórzyć po trzech tygodniach.


W przypadku próbek, które pochodzą z wczesnej fazy infekcji, zwykle dominują przeciwciała klasy IgM. Dlatego też bardziej intensywne prążki pojawiają się w teście potwierdzenia w klasie IgM, a reakcja z OspC jest bardzo charakterystyczna dla wczesnej odpowiedzi immunologicznej (IgM). Dość charakterystyczne jest też występowanie dodatniej reakcji z antygenem p41 w klasie IgM we wczesnych etapach choroby.


W przypadku surowic pochodzących od pacjentów w późnej fazie infekcji (IgG) zwykle obserwuje się silną reakcję z antygenami p100, VIsE, p58, p39 i p18. Przeciwciała przeciw OspA i OspB stwierdza się rzadko, jakkolwiek ich występowanie jest bardzo swoiste dla rozpoznania boreliozy.
Przeciwciała anty-VlsE mogą być bardzo wczesnym markerem odpowiedzi IgG, ale również często towarzyszą odpowiedzi immunologicznej w późnych objawach boreliozy z Lyme i pojawiają się w tych przypadkach razem z przeciwciałami skierowanymi przeciw p100 i/lub p18.



Najczęściej wykorzystywane w testach Western Blot antygeny krętków Borrelia burgdorferi i ich znaczenie diagnostyczne


Antygen Specyficzność Występowanie i znaczenie diagnostyczne
VisE Wysoce specyficzny Głownie późna faza boreliozy, ale może też występować na początku zakażenia
p100 (p83; p94) Wysoce specyficzny Charakterystyczny dla etapu III (późna borelioza)
p75 Niespecyficzny (HSP)
p66 Niespecyficzny (HSP) Występuje w I i II fazie choroby
p60 Niespecyficzny (HSP) Częste reakcje krzyżowe z innymi patogenami
p58 Specyficzny Późna faza choroby
p43 Niespecyficzny
p41 (flagellina) Niespecyficzny Silna odpowiedź w I fazie choroby (szczególnie w klasie IgM)
p39 (BmpA) Wysoce specyficzny Wykrywany we wszystkich fazach choroby
p35 (OspB) Wysoce specyficzny Rzadko wykrywany – głownie późna faza infekcji
p31 (OspA) Wysoce specyficzny Rzadko wykrywany – głownie późna faza infekcji
p30 Wysoce specyficzny
OspC
(p23-25)
Wysoce specyficzny Wykrywany w I fazie infekcji – wczesna i silna odpowiedź w klasie IgM
p21 Wysoce specyficzny Wczesna odpowiedź w I fazie zakażenia
p19 Niespecyficzny
p18 (Osp17, p17, DbpA) Specyficzny Wczesna odpowiedź w I fazie zakażenia, występuje również w późnych etapach infekcji





Pozytywny wynik testu potwierdzenia w klasie IgG nie w każdym przypadku wskazuje na aktywny proces chorobowy boreliozy z Lyme. Ponieważ przeciwciała klasy IgG zwykle długo się utrzymują, możliwe jest wykrycie przeciwciał pochodzących z przebytej infekcji Borrelia burgdorferi.


W przypadku podejrzenia klinicznego neuroboreliozy detekcja przeciwciał produkowanych wewnątrzoponowo jest najczęściej wystarczającym dowodem zakażenia. Wymaga to równoległego badania surowicy i płynu mózgowo - rdzeniowego w teście ilościowym (np. metodą ELISA). W dwuetapowej procedurze diagnostycznej, uzyskane wyniki pozytywne lub nieoznaczone mogą być potwierdzone w teście potwierdzenia przystosowanym do wykrywania przeciwciał w płynie mózgowo-rdzeniowym. Równocześnie wskazane jest wykonanie badania oceniającego szczelność bariery krew-mózg; np. na podstawie wyliczenia stosunków stężeń albumin i IgG w surowicy i pmr.


Reakcje krzyżowe w teście potwierdzenia WB z przeciwciałami powstającymi na skutek infekcji krętkami kiły (Treponema pallidum), gorączki powrotnej (Borrelia recurrentis, Borrelia duttonii, Borrelia hermsii) lub leptospirami (Leptospira sp.) są zminimalizowana z uwagi na zastosowanie rekombinowanych antygenów Borrelia burgdorferi. W przypadku aktywnego zakażenia kiłą, okazjonalnie stwierdzano występowanie przeciwciał przeciw antygenowi p41 B. burgdorferi. Stąd też w przypadku stwierdzenia pozytywnej reakcji tylko dla tego antygenu wskazane jest wykluczenie infekcji kiłą. Również w przypadku obecności przeciwciał heterofilnych w mononukleozie zakaźnej może wystąpić poliklonalna stymulacja limfocytów B, a to spowodować niespecyficzne reakcje podczas wykrywania przeciwciał w klasie IgM. Jeśli wywiad pozostawia wątpliwości a odpowiedź w klasie przeciwciał IgM jest słaba, zaleca się wykluczenie infekcji wirusem EBV z zastosowaniem odpowiednich testów diagnostycznych.


W przypadkach przewlekłego zakażenia Borrelia burgdorferi, gdy krętki (antygeny krętkowe) stają się mało dostępne dla komórek immunokompetentnych (są np. ukryte w OUN lub jamach stawowych, a także występują w postaciach wewnątrzkomórkowych), zalecane jest krótkie (np. 7-10 dniowe) podanie antybiotyków i/lub pochodnych imidazolu (metronidazol, tynidazol), które spowodują uwolnienie antygenów krętkowych i wznowienie produkcji specyficznych przeciwciał.


Wyniki badań serologicznych należy zawsze rozpatrywać razem z obrazem klinicznym. Jeśli wyniki badań serologicznych są niejasne lub nieoznaczone, zaleca się powtórzenie testu w czasie rozwoju choroby (np. po 3-4 tygodniach). Istnieją dane mówiące, że ujemne wyniki testów przesiewowych (ELISA) nie wykluczają w 100% możliwości infekcji B. burgdorferi (w teście ELISA jako antygen stosowane jest zazwyczaj tylko jedno białko krętka – w przypadku gdy nie ma odpowiedzi immunologicznej na ten antygen wynik testu jest ujemny, nawet przy aktywnym zakażeniu!). W tym przypadku zaleca się również wykonanie testu W-B, w celu pewnego wykazania seronegatywności.



Cena wykonania badania przesiewowego w kierunku infekcji Borrelia burgdorferi (test ELISA w klasach IgG i IgM) – wynosi 50 zł. W przypadku dodatniego wyniku testu konieczne jest wykonanie testu potwierdzenia (test Western Blot). Również w przypadku występowania objawów klinicznych sugerujących infekcję Borrelia burgdorferi i ujemnych wynikach testu ELISA konieczne jest wykonanie testu potwierdzenia.
Cena wykonania testu Western Blot wraz ze szczegółowym opisem badania (interpretacja prążków) i ostatecznym wnioskiem diagnostycznym wynosi 150 zł za 1 klasę przeciwciał.


dr hab. n. med. Tomasz Wielkoszyński
ODPOWIEDZ
  • Podobne tematy
    Odpowiedzi
    Odsłony
    Ostatni post